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1.4.2.2 Ablauf der Dunkelreaktion Der genaue Ablauf der Dunkelreaktion wurde erstmals bei Algenkulturen (Chlorella, Scenedesmus) durch Gabe von radioaktiv markiertem CO2 (14CO2), rascher Abtötung der Zellen und Extraktion mit heißem Alkohol mit chromatographischer Analyse geklärt. Neben 14C wurden auch andere b-Strahler wie 15N, 32P, 35S und 3H verwendet, um Stoffwechselwege aufzuklären. Man nennt diese Methode Isotopenmarkierung.
In Abb. 46 ist eine Chlorella-Kultur, in Abb 47 verschiedene Scenedesmusarten zu sehen. Chlorella wie Scenedesmus gehören zum Phytoplankton in Seen, Flüssen und Bächen (Chlorella auch im Boden).
Die Zellen wurden mit radioaktiv markiertem CO2 (14C) versorgt. Die Algen nahmen das CO2 auf und verstoffwechselten es. Alle daraus entstandenen Produkte waren somit ebenfalls radioaktiv markiert. Wenn man nun in bestimmten Zeitabständen den Stoffwechsel unterbricht, kann man die bis dahin produzierten Stoffe isolieren und durch ihre radioaktive Markierung und identifizieren. Calvin verwendete die Papierchromatographie, um die Photosyntheseprodukte zu trennen. Darauf wurde ein Röntgenfilm gelegt. Die Schwärzung des Films zeigte die Lage der entstandenen Produkte an. Diese Methode nennt man Autoradiographie.
In Abb. 48 ist ein Autoradiogramm eines Acrylamidgels ( hier DNA-Fragmente) zu sehen. Die grauen und schwarzen Banden enthalten unterschiedliche Menegen an radioaktiv markierten Substanzen. Nun konnten die Produkte, die das 14C enthielten identifiziert werden. Heute verwendet man auch andere chromatographische Verfahren wie die Flüssigkeits-Szintillationschromatographie oder Gelelektrophorese um die Auftrennung zu ermöglichen. Hochempfindliche Autoradiographie-Filme zusammen mit digitaler Analyse ermöglichen eine genaue Analyse (<100 mm). Neben der Isotopenmarkierung gibt es auch eine nicht-isotopische Markierung durch Farbstoffe. Die Stoffwechselzwischenprodukte können dann durch z. B. Fluoreszenzspektroskopie analysiert werden. Bei der Dunkelreaktion der Photosynthese ergab sich als erstes entstandenes Produkt die 3-Phospho-Glycerinsäure (PGS), deren Konzentration bis 25 Sekunden nach 14CO2-Gabe stark anstieg. Weitere Analysen der beteiligten Stoffe klärten den gesamten Dunkelstoffwechsel auf, inklusive der beteiligten Enzyme. Gleichzeitig mit dem Anstieg der PGS-Konzentration war nämlich ein Absinken der RuDP-Konzentration zu beobachten. Dies und andere Ergebnisse führten zu der Erkenntnis, daß die phosphorylierte Pentose Ribulose-1,5-Bisphosphat (RuBP) der CO2-Akzeptor der Photosynthese ist. Diesen 1. Abschnitt der Dunkelreaktion nennt man |
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Das CO2 wird an die Ribulose-1,5-Bisphosphat gebunden, wobei ein Zwischenprodukt mit 6 C-Atomen ensteht (C6-Körper), das sofort in 2 C3-Körper (PGS =3-Phosphoglycerinsäure) zerfällt. Diese Reaktion ist stark exergonisch mit DG = -52.08 KJ/Mol. Das Enzym, das die Bindung an RuDP katalysiert heißt RuBP-Carboxylase/Oxygenase (RuBisCO), und ist das am häufigsten produzierte Enzym aller Lebewesen. 15% aller Proteine der Chloroplasten sind RuBisCO. In Abb. 50 sind mit Gold markierte RuBisCO-Kristalle in einem Granum eines Chloroplasten zu sehen. Die genaue Proteinstruktur ist bekannt (EC: 4.1.1.39). RuBisCo besteht aus 8 Untereinheiten mit jeweils einem katalytischen Zentrum (siehe im RASMOL-Modell unten). Es wird durch ein Metabolit der Dunkelreaktion inaktiviert, der nachts gebildet wird und am Tag zerfällt.
Die 3-PGS wird in der 2. Phase des Calvinzyklus zunächst in 1,3-Diphosphoglycerinsäure (1,3-DiPGS) umgewandelt. Diese wird dann in 3-Phosphoglycerinaldehyd (3-PGA) reduziert. Dazu werden Elektronen, Wasserstoff und Energie benötigt und die Primärprodukte ATP und NADPH+H+ verwendet. Man diese Phase Reduzierende Phase. |
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Die direkte Reduktion von 3-PGS ist energetisch nicht möglich, deshalb wird zuerst die 3-PGS durch Phosphorylierung auf ein höheres Energieniveau gehoben und kann dann reduziert werden. In der 3. Phase geschieht zweierlei:
Deshalb heißt diese Phase Regenerierende Phase. |
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Aus Fructose-6-Phosphat (F6P) entsteht Glucose-6-Phosphat (G6P), aus dem dann entweder Stärke oder die Transportform Saccharose oder Cellulose gebildet wird. Die Zwischenprodukte des Calvinzyklus dienen im Intermediärstoffwechsel zur Herstellung von Aminosäuren usw. Da RuDP wieder regeneriert wird (über mehrere Zwischenschritte), läuft der Gesamtvorgang zyklisch ab.
Um jedoch sowohl Glucose (C6-Körper) als auch den Akzeptor RuDP (C5-Körper) zu synthetisieren, muß der Zyklus 6 mal durchlaufen werden. 6 C1
(CO2) + 6 C5 =30 (RuBP) ---->12 C3 =
36 (3PGS) ----> 12 C3 = 36 (3PGA) Die Gesamtreaktion sieht folgendermaßen aus: 6CO2 + 12 NADPH + 12
H+ + 18 ATP ---->
1.4.2.3 Zusammenfassung der Photosynthese Wir können nun die Gesamtreaktion der Photosynthese aus Licht- und Dunkelreaktion formulieren. Da 12 NADP benötigt werden, müssen auch 12 H2O-Moleküle photolysiert werden. Zusammen mit dem Calvinzyklus ergibt sich die Bruttogleichung der Photosynthese:
6CO2 + 12H2O ----> C6H12O6 +6O2+ 6H2O DG°´= + 2994 KJ/Mol
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